半导体工程师 2025年05月21日 09:11 北京

冷冻电镜样品制备质料对最终实验扫尾至关进军。本文详备先容了从载网遴荐到数据聚集的完整使命经由，强调载网的质料评估、正确处理和存储对辞让稠浊和损坏的进军性。推崇了名义处理工夫（如等离子体处理）对优化卵白质样品在玻璃态冰中散布的影响，以及全金载网、石墨烯等材料若何显赫提升样品瓦解性和减少电子束放射下的样品出动。精准戒指的样品玻璃化过程和优化的成像参数是获取高分辨率结构数据的基础。

L.A. Passmore, C.J. Russo, Specimen Preparation for High-Resolution Cryo-EM, Methods in Enzymology,2016

1. 载网的遴荐、处理与储存

载网质料评估与遴荐

在冷冻电镜样品制备过程中，载网的质料径直影响最终的实验扫尾与数据可靠性。这些微米级的精密载网极易受到物理毁伤或环境稠浊，因此必须严慎处理。在实验脱手前，应使用光镜对载网进行全面搜检，实时淘汰存在显然盘曲、大面积破碎或稠浊的载网。

尽管这一预检要领看似繁琐，但与后续样品制备和成像过程所浮滥的时分比较，这一参加可有可无，却能显赫提升实验的见效用和数据质料。

就载网类型而言，商场上既有不国法陈设（如蕾丝状或多孔碳）的载网，也有具有国法孔洞阵列的居品（如Quantifoil、UltrAuFoil、C-flat等）。后者因其结构的高度规整性，不仅提供了更好的实验重迭性，还能简化数据聚集有策划，因此在高精度权衡中更受疼爱。

在材料遴荐方面，针对不同的应用场景，咱们（L.A. Passmore, C.J. Russo）有如下冷落：负染色工夫可选用铜基底上的无定形碳（am-C）载网，这类居品遍及易得且价钱适中；而冷冻电镜应用则保举使用全金载网，因其能灵验减少样品在电子束照耀下的出动，显赫提升成像质料。全金载网不错按照Russo和Passmore（2016）描摹的有策划自行制备，或径直从Quantifoil等供应商处购买买卖化居品（如UltrAuFoil®）。

载网的正确处理有策划

载网的处理工夫看似绵薄，实则需要致密操作。关键原则是恒久保持载网平整，幸免任何可能导致薄膜损坏的弯折。在操作过程中，应当使用厉害的精密镊子，仅从载网的边际进行夹持和出动（图3）。咱们寥落保举使用常闭构型的镊子（如Dumont N5型），这类镊子能在处理过程中对载网施加明确且可控的力度，减少东说念主为操作互异导致的载网毁伤。

图3 镊子对样品载网的损坏。盘曲的镊子（A）或不妥使用（B）会导致样品载网损坏。为取得最好效果，应使用尖锐、成功的镊子（C），而且仅从边际处夹取载网（D）。对于A和C面板，比例尺为1毫米。对于B和D面板，比例尺为100微米。

在处理过程中，静电放电是另一个常被忽视却能形成严重损害的因素。指挥腕部接地带是一种绵薄灵验的防静电设施（图4）。值得把稳的是，咱们不冷落在操作镊子的手上指挥手套，尽管这在某些实验环境中是尺度作念法，但在载网处理中，手套不仅会导致镊子和载网上积聚静电，还会编造操作的贤惠度和精准性。

图4 存放载网以幸免稠浊和静电。A面板展示了载网处理中的不良作念法：使用手套和塑料存储盒会导致静电积聚。图中，带电的载网正立在边际上。B面板展示了保举的处理轨范，包括使用玻璃容器，拿镊子的手不戴手套，以及指挥腕部接地带以辞让静电积聚。

载网的储存环境与条目

经过清洁或修饰的载网应当妥善储存，以保管其名义性质和结构完整性。最好的储存容器是玻璃培养皿，而非塑料成品，因为后者可能开释有机残留物，稠浊载网名义。储存环境应为干净、无油脂的干燥盒，确保环境中无尘埃颗粒。这种严格的储存条目对于保管载网的高质料景色和实验的可重迭性至关进军。

为辞让样品交叉稠浊并扼杀环境稠浊物，通盘用于载网处理的器具、玻璃载片和容器都应如期进行透澈清洁。玻璃成品可通过在高纯度洗涤剂溶液（如2%的Micro-90）中进行超声波处理，随后用超纯18 MΩ去离子水充分冲洗的面貌进行清洁。镊子在日常使用后，可领受酒精（酒精或异丙醇）超声波清洗；如发现存塑料或油脂残留物的稠浊，则需使用更强效的溶剂，如氯仿和丙酮进行处理。

寥落需要强调的是，用于载网冷冻的镊子应在每次处理不同样品后进行透澈的酒精超声波清洗，以扼杀潜在的稠浊。本质标明，通过镊子从一个载网到另一个载网的交叉不分青红皂白常遍及的风景，这种微量稠浊虽难以察觉，却可能对实验扫尾产生显赫影响。在高精度结构分析中，这种看似轻微的细节经常是确保数据可靠性的要道因素。

2.载网的稠浊戒指与清洁工夫

即使在最优化的储存条目下，载网在使用前仍可能需要颠倒的清洁处理。稠浊开头多种各类，主要包括以下几类：

颗粒物资稠浊：包括挥发的碳片、制造过程中的残留颗粒或储存过程中积聚的环境灰尘。这些颗粒物资如不足时撤消，会在加入水性卵白质溶液时再行悬浮，并最终在玻璃态冰中形成可见的杂质，侵犯后续的数据处理与分析。

有机残留物稠浊：主要开头于处理或储存过程中千里积在名义的有机物资，以及制造过程中使用的光刻胶或其他高分子材料及溶剂残留。这类稠浊物会显赫影响载网的润湿性和其他物理化学特质，编造实验的可重迭性和扫尾的一致性。

以下提供一种通过水和溶剂系统清洗来净化载网的有策划。需要寥落把稳的是，清洁过程中应使用超高纯度（CMOS级）溶剂，以幸免引入新的稠浊物。咱们不保举领受加热法清洁载网，因为高温可能摧毁载网的结构完整性，导致薄膜变形或断裂。

安全劝诫：本有策划波及使用高电压、高温、液态氮、易燃化学品/气体，以及在真空条目下操作的建筑。这些操作应由训戒丰富的科学东说念主员奉行，且操作家应已完成通盘有关的安全培训并进行了风险评估。请务必指挥安全眼镜和稳当的防御装备，并自行承担操魄力险。

有策划1.（载网清洁轨范）

1.用高纯度去离子水（18 MΩ，经过滤与UV处理）填充干净的玻璃结晶皿（保举使用Pyrex材质，直径90毫米，高50毫米）。水应添加至稍许溢出容器边际，以冲破名义的弯液面，灵验去除水名义上可能存在的任何稠浊层（图5C）。

图5 去除样品载网上的名义稠浊。载网不错循序用（A）氯仿、丙酮和异丙醇清洗。必须把稳幸免水（或溶剂）名义的稠浊物千里积到载网上。B面板展示了一个透露图。如C面板所示，容器装得过满不错减少名义稠浊。比例尺为20毫米。

2. 准备三种溶剂洗涤液，永诀置于干净的小玻璃试管中（图5A）：

试管一：1毫升氯仿（冷落使用Sigma 650498或同等纯度居品）

试管二：1毫升丙酮（Sigma 40289或同等品）

试管三：1毫升异丙醇（Sigma 40301或同等品）

溶剂操作应使用玻璃巴斯德吸管，因为多数有机溶剂会溶化塑料成品，可能导致塑料残留物再行千里积于载网名义。

3. 使用干净的精密镊子（Dumont N5或5型）注重夹取单个载网，将其安然浸入晶体皿一侧的水中。此时，载网名义的松散稠浊物可能会飘扬至水面。为幸免这些飘扬稠浊物再行千里积到载网上，应将载网横向穿过水，从晶体皿的另一侧取出。在穿水过程中，确保载网的薄边际朝前，以减少对穿孔薄膜的毁感冒险。取出后，将载网边际轻轻搏斗滤纸（Whatman No. 1型）以去除满盈水分，但务必把稳不要使载网发生弯折。如使用非防毛细管镊子，应在镊子尖之间进行吸干操作。

4.循序将载网浸入前述准备的三种溶剂中，每种溶剂浸泡10-20秒。终末一步的异丙醇漂洗尤为要道，应使用最洁白的溶剂，因为此阶段的任何残留物都将径直千里积在载网名义。如使用非防毛细管镊子，每次漂洗后应在镊子尖之间吸干满盈溶剂。

5.将载网边际轻触滤纸，去除残留的异丙醇。

6.将载网扬弃在干净玻璃培养皿（冷落使用Schott，70毫米型号）中的滤纸（Whatman No. 1，70毫米圆形）上，薄膜面进取，自然晾干。培养皿应盖上玻璃盖，减少环境灰尘的千里积。

7.全都干燥后，载网应存放在有盖的玻璃培养皿中，但最好本质是在清洁后尽快使用，以确保名义特质的瓦解性。

3. 非晶碳和石墨烯连气儿薄膜的制备与应用

非晶碳或石墨烯的连气儿薄膜为卵白质样品提供了一种与基底互相作用的替代名义。在特定情况下，这类薄膜不错显赫改善卵白质在玻璃态冰中的散布景色或分子取向。此外，由于颗粒不错在吸走满盈液体前吸附到薄膜名义，因此有时不错使用较低浓度的卵白质溶液，这不仅简约了可贵的样品，还能优化成像条目。

以下提供一种制备薄层（2-5nm）非晶碳薄膜的详备有策划，该薄膜可四肢颗粒吸附的理思名义。同样的有策划也适用于制备较厚（5-10 nm）的碳薄膜，可迁移至无穿孔薄膜的裸载网上用于负染色工夫。

有策划2.（非晶碳千里积轨范）

本有策划基于使用配备水冷式Inficon晶体厚度监测器的Edwards 306 Turbo镀膜系统将碳千里积到云母片上的经由，但可左证实验室现存建筑进行稳当调养。

1 绽开系统透风口，移除防爆罩和玻璃钟罩。

2 操作前戴上无粉末稠浊的干净手套，并在处理腔内通盘组件时保持手套指挥景色。

3 取下碳源安装，移除屏蔽罩，在夹头中安装一根新的尖锐碳棒（应选用高纯度石墨，杂质含量<5 ppm），并保持稳当的机械张力。

4 使用压缩氮气透澈吹除任何碳屑或碎屑，这些轻微颗粒可能导致电极间短路，影响千里积质料。

5 将碳源安装再行扬弃于真空腔内，调养碳棒位置使其距离样品台约125毫米。固定时仅需用手指拧紧螺母，无需使用扳手，以幸免过度应力。

6 云母四肢一种多层矿物晶体，具有极其平整的名义特质（每普通毫米均方根通俗度小于1纳米），且易于获取大面积样品，因此被无为用作碳千里积的模板基底。取一派云母（如Agar G250-1型号），用刀片将其一分为二，将两片云母片扬弃于样品台上，劈裂面进取，径直位于碳源正下方，并放在新的滤纸（Whatman No. 1）上。云母应在涂覆前立即崭新劈开，因为新劈开的名义具有理思的清洁度和亲水性，而在空气中万古分涌现后会被环境稠浊物覆盖，导致名义疏水化。

7 可使用一枚干净的金属硬币或雷同小金属片在真空抽气过程中固定云母片和滤纸，辞让移位。

8 搜检挡板在开启和关闭景色下的位置：关闭时应全都覆盖从碳源到云母和晶体厚度监测器的立体角；开启景色下，通向云母和晶体的旅途应无坚苦且旅途长度寥落。启动景色应保持在关闭位置。

9 仔细搜检钟罩垫圈和底板是否存在灰尘、污垢或碳、金属碎屑。如有必要，使用无绒纸和高纯甲醇进行透澈清洁。

10 再行安装玻璃钟罩和防爆罩。

11 填充液氮冷阱至稳当液位。

12 按下戒指面板上的轮回按钮启动真空抽气过程。

13 当门阀绽开时，系统压力应速即降至10^-5托界限。此时不错通过绽开低压电源（LT）并安然加多电流至约1.0安培，脱手预热碳源安装。

14 恭候10分钟后，将电流安然加多到1.2安培。

15 再恭候5分钟，将电流加多到1.4安培。

16 在1.4安培保管20分钟，随后关闭电源。此时应补充液氮至冷阱。

17绽开晶体厚度监测器的冷却水系统，并阐述已遴荐正确的碳轨范参数。将厚度自满归零。

18 系统真空度应在约一小时内降至10^-7托界限，这是进行高质料碳千里积的必要条目。

19 一朝真空度达到<5×10^-7托，在约5分钟内安然将电流再次加多到1.6-1.7安培，把稳戒指加多速率以幸免电弧放电。在碳源加热过程中，系统压力不应升高至>5×10^-6托。

20 当碳脱手千里积时，电流雷同将出现细微波动。此时绽开挡板进行10-20秒的千里积，随后关闭挡板并稍许编造电流。

21 晶体监测器在启动阶段可能会由于热效应自满负值，但在关闭挡板后，自满值将规复至一个正数，这代表了累积的碳膜厚度。可重迭上述过程直至达到所需厚度。

22 完成千里积操作后，关闭挡板并全都关闭碳源电源。

23 在透风绽开系统前，应让真空腔冷却至少30分钟，以确保千里积碳膜的瓦解性。

24 使用干燥氮气安然透风，取出涂覆的云母片并存放在洁净的玻璃培养皿中。

25 再行安装钟罩和防爆罩，按下轮回按钮启动抽真空，待真空度达到200毫托后，按下密封按钮完成系统密封。

进军把稳事项

晶体厚度监测器应按照制造商的说明，使用零丁的厚度测量有策划如期校准。在咱们往日的权衡中，曾使用原子力显微镜进行此类校准（Russo & Passmore, 2014a）。碳密度可能因源材料质料而略有互异，但经常应约为2.2 g/cm³。从启动到完成，通盘这个词千里积过程不应高出4小时。除非使用全都干燥（无油）的抽气系统，不然不冷落过夜抽气，因为当液氮阱温度回升时，泵油可能回流至腔体，形成系统和云母样品的油稠浊。咱们在之前的权衡中提供了一个将非晶碳迁移到各类载网上的详备有策划（Russo & Passmore, 2016），该有策划在Quantifoil和全金载网上均阐发出色。这一溜移有策划在有策划3中有详备描摹，可四肢制备高质料碳薄膜载网的进军补充工艺。

有策划3：无定形碳向载网的迁移

实验操作过程中，静电放电可能对载网形成弗成逆毁伤，因此必须采取稳当防御设施。同期，载网的质料戒指亦然实验见效的基础。具体操作要领如下：

1指挥腕部接地带，辞让在操作过程中产生静电而损坏载网。使用镊子时，操作家不应指挥手套，或确保镊子径直接地，以扼杀静电积聚的可能性。

2 在电镜下仔细搜检载网，剔除任何存在盘曲的部分。及格的载网应当名义平整、结构连气儿，且无灰尘或纤维状杂质附着。

3 若发现载网名义存在光刻处理残留的塑料物资，可依照有策划1进行透澈清洁处理。

4 为辞让指纹和外源稠浊，指挥手套将滤纸（Whatman No. 1，直径70毫米）置于不锈钢网圆片（直径65毫米，由0.7毫米线制成，载网为3毫米）上。该网片应扬弃在玻璃结晶皿（Pyrex材质，直径90毫米，高度50毫米）中的不锈钢环（经抛光和倒角处理的边际，厚度2毫米，高度10毫米，直径50毫米）内（参见图6）(Russo & Passmore, 2016)。

图6 在载网上千里积无定形碳薄膜的安装。A面板自满了浮动室的横截面图。跟着水位的编造，无定形碳的薄膜被千里积到载网上。不锈钢环形成一个正弯月面，匡助将碳膜向环的中心编造。B面板自满了该安装使用中的像片。doi: 10.1016/j.jsb.2015.11.006。

5 用高纯度去离子水（18 MΩ，经过滤和UV处理）填充结晶皿。注水至溢出景色以摧毁名义张力形成的弯月面，并去除水名义的任何潜在稠浊层（参见图5C）。随后倾倒满盈水分，使水位恐怕低于玻璃皿边际。

6 使用经溶剂冲洗清洁的镊子（Dumont N5或5型号），严慎地将载网扬弃在滤纸中央，箔面进取。载网应垂直于水面安然浸入，以幸免气泡形成和载网损坏。

7 设立虹吸系统：将管说念（长0.6米，外径3.2毫米，内径1.6毫米）通达至配有常闭镊子或弹簧夹的网罗容器。通过打针器启动虹吸流动，并在碳膜飘扬过程中（下一要领）暂时夹住管说念戒指流速。

8 通过以20-30°角安然将一派约2.5×2.5厘米的无定形碳涂覆云母片（碳面进取）浸入水中，使碳膜从云母基底飘扬分离。可领受掠角光源照耀水面，增强对飘扬碳膜的可视化不雅察效果。

9 借助虹吸系统渐渐编造水位，戒指碳膜的着落速率。

10 密切监控碳膜相对于载网的位置，必要时用清洁的镊子轻推调养，确保碳膜恒久保持在载网中央位置。

11 当碳膜全都千里积于载网名义且水位降至低于滤纸时，注重取出不锈钢环。随后取出滤纸与网片合座，置于干燥滤纸上，并用洁净的玻璃培养皿或烧杯覆盖，覆盖物应稍许歪斜以留出水分挥发空间。令其在室温下自然干燥数小时。

12全都干燥后，将制备好的样品置于洁净的玻璃培养皿中保存，直至使用前。

石墨烯四肢新式二维材料，因其笃定的晶格结构和不凡的导电性能，在多方面优于传统的无定形碳。尤为进军的是，在冷冻电镜柔和的分辨率界限内，石墨烯实质上简直弗想法，而无定形碳则会引入颠倒的配景噪声，这对于权衡较小卵白质结构寥落不利。以下内容详备先容将石墨烯迁移到Quantifoil载网上的精准轨范（参见图7，有策划4）(Regan et al., 2010)。

此迁移过程需使用超高纯度（CMOS级）溶剂和酸性试剂以确保迁移的可靠性并幸免稠浊。通盘这个词操作过程中，操作家应恒久指挥腕部接地带，辞让静电放电损害载网，因石墨烯薄膜对静电寥落明锐。通盘玻璃器皿在使用前必须经过透澈清洁。值得把稳的是，全金属载网的新式迁移有策划正在研发中，异日石墨烯全金载网有望竣事买卖化供应。

有策划4：石墨烯向载网的迁移

1 仔细搜检新清洁的载网（Quantifoil Au 300 1.2/1.3，参照有策划1的清洁有策划），剔除任何存在盘曲的载网。

2 石墨烯经常通过化学气相千里积(CVD)有策划助长在薄铜基底上，可从专科买卖供应商（如Graphene Supermarket，Structure Probe Inc.等）购买。从已阐述存在石墨烯的铜/石墨烯源材料上冲压出3.2毫米的圆盘（图7B，C）。本实验室领受定制的机械冲头，此类器具亦可从Structure Probe, Inc.获取。

图7 石墨烯迁移到带有碳膜的撑持物上。该过程在A面板中以图表局势展示。B和C面板自满在空气中加热至150°C不时10分钟的铜，其中B全都覆盖着石墨烯因此不会氧化，而C莫得石墨烯覆盖因此由于氧化而变色，比例尺为3毫米。这种绵薄的测试用于标记箔片上石墨烯的位置。D和E面板自满载网-石墨烯-铜三明治结构，比例尺永诀为1毫米和10微米。F面板展示了在蚀刻剂中飘扬的三明治结构，其中不错看到部分被蚀刻的铜晶粒（比例尺1毫米）。G面板是带有冰的悬浮石墨烯的电子衍射图案，箭头指向来自石墨烯晶格的2.1埃反射。

3 将经搜检的载网置于每个圆盘上，箔面朝下。

4 将拼装好的结构夹在两片洁净玻璃片之间加压，随后移除顶部玻璃片。

5 使用洁净移液管，在载网-石墨烯-铜三明治结构顶部精准加入7微升异丙醇（Sigma 40301）并待其自然干燥。

6 在高分辨率光镜下仔细搜检，阐述碳箔是否与铜名义充分附着。见效附着的区域会呈现显然的心绪变化（图7E），唯有附着高超的区域才智在后续要领中见效迁移。

7 在透风橱内有序摆放并象征七个硼硅酸盐玻璃结晶皿（直径70毫米）。

8 在第一个结晶皿中注入约2/3容量的含缓冲FeCl3的铜蚀刻剂（Sigma 667528）。

从玻璃片轻轻滑动，将载网圆盘三明治结构注重扬弃在FeCl3液面上。使用硼硅酸盐玻璃培养皿盖（直径80毫米）覆盖，辞让蚀刻过程中灰尘侵入。

9 在FeCl3溶液中进行蚀刻约20分钟（适用于25微米厚的铜基底）。

10 永诀在三个结晶皿中注入约2/3容量的20% HCl（Sigma 40233）、20% HCl和2% HCl溶液。

11 愚弄经火焰处理的铂环（平正或EMS 70944）将载网一一溜移至各溶液皿中。每个要领中让样品飘扬10分钟，完成充分清洗。

12用最高纯度的去离子水填充另外三个结晶皿，四肢最终清洗要领。

13 连续使用铂环迁移工夫，在每个水浴中冲洗样品3-5分钟。

14 终末一次使用铂环迁移并翻转样品，使石墨烯面进取，扬弃在滤纸上（Whatman No. 1，70毫米圆片）。将其置于洁净的硼硅酸盐玻璃培养皿（70毫米）中自然干燥。

15 将实验产生的酸性废液按照实验室章程的危机废料处理经由稳当惩办。

16 耐久保存时，应将样品置于无任何油类或碳氢化合物的干燥环境的玻璃容器中。切勿使用任何类型的塑料容器存储，以幸免潜在稠浊。

4 载网名义处理工夫

载网名义经常呈疏水性，这会掩饰水溶液在其名义的灵验铺展，影响样品制备质料。为精准戒指名义亲水性，可领受死板等离子体处理工夫（图8）。此过程中，从低压气体产生的离子息争放基与名义发生互相作用，一方面去除残留有机稠浊物，同期与名义进行化学反馈以编造其疏水性。

图8 辉光放电产生的等离子体。图中展示了三种不同仪器产生的残留空气等离子体。这些仪器都能灵验加多撑持名义的亲水性，但具有不同进程的可重迭性，并可能损坏撑持物。需要把稳的是，辉光放电安装中的等离子体经常是不均匀的，这可能导致涌现剂量显赫变化，即使在归拢批次中亦然如斯。比例尺为20毫米。

自然不错使用剩余空气产生的等离子体（即辉光放电工夫，见有策划5），但为追求更高的实验重迭性，咱们保举使用因素可控的等离子体系统（有策划8）。等离子体处理经常领受氩气:氧气搀杂物，某些情况下也可使用氢气（有策划7）。此外，还可引入戊胺等功能性分子来修饰名义特质，改变待分析颗粒在名义上的取向散布（有策划6）(da Fonseca & Morris, 2015）。

有策划5：载网的辉光放电处理

1 在电镜下仔细搜检已清洁的载网，剔除任何有盘曲的样品。通盘载网应确保平整、连气儿，且无灰尘或纤维状杂质。

2 将及格的载网放入辉光放电安装（如Edwards S150B）的真空腔室内，置于洁净玻璃片上，箔面进取，位于台面中央位置。处理放入腔室的任何物品时必须指挥手套，辞让稠浊。

3将腔室抽真空至200毫托压力。

4 开启高压电源至7千伏，电流应瓦解在28-30毫安界限内。

5 对载网进行精准30秒的处理。

6 处理完成后关闭高压电源，安然透风腔室规复大气压。

7 将处理过的载网置于洁净玻璃培养皿中保存，并应在1小时内使用，以取得最好效果。

在最近的一篇Nature文件中，权衡请问了去甲肾上腺素转运卵白(NET)的冷冻电镜结构，包括游离态、底物联接态以及与六种抗抑郁药联接的复合物局势。

左证文件内容，在冷冻电样品制备过程中，权衡东说念主员将2.3μl纯化的NET卵白(浓度为1.2mg/ml)应用到经过辉光放电处理(Coolglow, SuPro Instruments)的多孔碳载网上(Quantifoil R1.2/1.3 Au 300 mesh)。

辉光放电处理后(Coolglow, SuPro Instruments)的多孔碳载网放大图，提升碳载网名义的亲水性，使卵白质溶液粗略更均匀地散布在网格名义，匡助形成更薄、更均匀的冰层，改善样品的分散性，辞让卵白质分子聚积匡助形成更薄、更均匀的冰层。

去甲肾上腺素转运卵白(NET)的冷冻电镜图片

在辉光放电处理后，满盈的液体被Vitrobot Mark IV建筑去除，然后载网被速即冷冻在液态乙烷中，以保持卵白质的自然景色用于随后的冷冻电镜不雅察和结构分析。

有策划6：载网的戊胺等离子体处理

1在电镜下仔细搜检载网，剔除任何存在盘曲的样品。通盘载网应确保平整、连气儿，且无灰尘或纤维状杂质。

2 将及格的载网扬弃在腔室内的洁净玻璃片上，箔面进取，准笃定位于电极环的中心位置（图8）。

3在腔室台面边际扬弃一个装有0.5毫升戊胺的袖珍玻璃瓶。

4用钟罩覆盖通盘这个词系统，将腔室抽真空至低于400毫托压力。

5 启动高压电源，调养功率参数直至形成均匀瓦解的等离子体（在咱们使用的系统中，经常约为90伏，1.5安）。

6对载网进行30-60秒的精准处理。

7处理完成后关闭高压电源，安然透风腔室规复大气压。将使用过的戊胺瓶按照稳当的废料处理经由惩办。

8将处理过的载网存放在洁净的玻璃培养皿中，并应在1小时内使用，以确保名义修饰效果。

有策划7：氩氧等离子体处理

1在电镜下仔细搜检载网，剔除任何存在盘曲的样品。通盘载网应确保平整、连气儿，且无灰尘或纤维状杂质。

2咱们使用配备自界说吊挂载网的Fischione 1070等离子体腔，该载网最多可同期容纳10个载网（图9）。在此成就中，载网与射频线圈的距离保持在约15±1厘米。为提升批次间曝光的重迭性，冷落恒久将载网相对于等离子体源保持在雷同的空间位置。或者，也不错将样品径直放在腔室内的洁净玻璃片上，箔面进取，置于腔室的载网上。

需把稳的是，未经高超屏蔽或能量过高的等离子体可能融会过溅射效应损坏金属载网；应尽量幸免这种情况发生。每批次最多可处理20个载网。操作过程中应恒久指挥手套处理通盘进入真空腔的物品，辞让稠浊和指纹残留。

图9 用于名义改性的特定等离子体的产生。(A和B) Fischione Model 1070和Gatan Solarus产生具有特定因素的等离子体。(C) MRC LMB制造的定制样品台的像片（上）和透露图（下）。图中自满了两种不同的夹具想象——一种用于涌现撑持物的一侧，另一种用于涌现两侧。盖子用于辞让载网在处理过程中出动。(D) 等离子体产生的透露图。

3将腔室抽真空绝顶高真空度（≪10^-4托）。

4 精准戒指通入高纯度氩气和氧气（BOC 99.9999%）的比例为9:1，保管压力在21毫托（相等于31.0 SCCM气体流量）。

5 施加射频等离子体，正向功率戒指在38瓦，反向功率保持在2瓦（Fischione 1070建筑上的70%功率设立），不时时分为10-60秒（对大多数载网而言，20-30秒为最克己理时分）。可左证实质需求优化处理时分以取得稳当的亲水性（影响水溶液的铺展性和冰的厚度）。

对于含碳的非晶载网，冷落通过进行几次渐渐加多剂量的等离子体处理，并笃定已知厚度的碳层全都被蚀刻所需的时分，从而训戒性地校准碳蚀刻率。

6 对于寥落薄的连气儿碳膜，应领受19:1的氩:氧比例和编造的功率（35瓦正向功率），镌汰处理时分至5-15秒，以幸免过度蚀刻。

7处理完成后排气等离子体腔，取出载网并应在1小时内使用，以取得最好名义亲水性效果。

使用死板量氢等离子体工夫，不仅不错灵验去革职义稠浊物，还能精准戒指卵白质在石墨烯名义的吸附行径。以下胪陈使用Fischione 1070等离子体系统和Dominik Hunter型号20H-MD氢气发生器（径直通达到等离子体发生器的输入端口）进行氢等离子体处理的尺度化经由。

值得强调的是，自然氢等离子体处理工夫具有高超的瓦解性，但为最大规则地减少修饰名义后稠浊物的积聚，冷落在样品行将使用前进行此处理。这种实时性对于保持名义修饰效果至关进军。

石墨烯因其不凡的机械强度、极薄的厚度及优异的导电性，已成为冷冻电镜样品制备的理思解救材料。然则，未经处理的石墨烯名义疏水性强，不利于样品的均匀散布。氢等离子体处理是提升石墨烯亲水性的灵验有策划，其精照实施对样品性量具有决定性影响。

氢等离子体处理通过将氢原子引入石墨烯名义，形成部分氢化石墨烯，从而改变其名义特质。戒指氢离子能量至关进军，过高的能量(>21电子伏)可能导致碳晶格结构毁伤，而非预期的化学修饰。此外，处理时分的精准戒指同样进军，以达到稳当的亲水性同期保持石墨烯的完整性。

有策划8：石墨烯载网的氢等离子体处理

1高纯度气源与建筑要求：必须使用超高纯度氢气(纯度>99.999%)、全不锈钢管说念及配件(严禁使用塑料部件)以及超高纯度等第蜕变器，确保处理过程不引入稠浊物。

2等离子体参数优化：线圈至样品的距离需精准戒指，径直影响氢离子能量。理思情况下，应确保样品处氢离子能量低于21电子伏溅射阈值，可通过朗缪尔探针测量等离子体能量与距离的关联。或者，可通过对比处理前后石墨烯载网的完整性来考据能量参数是否合适。

3等离子体腔预处理：在精采处理前，应将等离子体腔抽真空至远低于10^-4托，4并使用100%纯氢(35瓦正向功率，<2瓦反向功率，20 SCCM气体流量)在空载网中进行10分钟的预烧毁，仅在装载前排气。

5石墨烯载网处理：将石墨烯载网安装在样品杆上，装入等离子体腔并抽真空至远低于10^-4托。使用雷同设立，进行5-40秒(经常20秒)的氢等离子体处理。处理完成后应立即取出并使用，以确保名义特质不发生变化。

5 样品玻璃化工夫

玻璃化工夫四肢冷冻电镜样品制备的要道有策划，起初由Jacques Dubochet过甚共事于20世纪80年代设备。该工夫的中枢在于通过快速冷却，使卵白质溶液中的水保持非晶态、非结晶景色，从而形成玻璃态冰。

见效制备玻璃态冰需餍足特定条目：样品必须在极短时天职（不到10^-4秒）阅历约200K的温度编造，冷却速率必须高出10^5-10^6 K/s（Dubochet，1988）。由于水的导热性能较差，样品厚度必须戒指在3μm以下以确保均匀快速冷却。

刻下商场上存在多种手动及半自动化冷冻浸渍安装，包括FEI、Leica、EMS和Gatan等公司提供的买卖建筑，这些建筑粗略提供可控的温度与湿度环境，灵验辞让样品挥发，提升制备过程的可重迭性。

值得把稳的是，在样品处理过程中，即使极微量的水分挥发（相等于几百层水分子单层）也可能导致悬粗俗层中盐浓度升高，pH值变化幅度可达两倍或更多。举例，在4°C和90%相对湿度条目下，挥发速率约为10nm/秒，这意味着在吸援助冷冻之间的2秒内，一个40nm厚的薄膜可能被浓缩至原本的一半，引起显赫的浸透压和卵白质构象变化。

因此，冷落在样品载网周围保管100%相对湿度，辞让冷冻前溶质浓度发生不利变化。在4°C环境下操作尤为理思，因为此温度下达到饱和所需水蒸气量较少，更容易将露点提升至环境温度，从而灵验辞让挥发。

样品加载至载网后，应速即完成后续要领，以最大规则减少卵白质与潜在摧毁性气水界面的搏斗时分。

对于玻璃化轨范的详备商议可参阅Dobro、Melanson、Jensen和McDowall（2010）的综述著述。以下使用Vitrobot（FEI）的轨范适用于全金和尺度Quantifoil载网。

有策划9：尺度玻璃化轨范

环境准备：用18 MΩ去离子水填充冷冻浸渍器水箱，均衡至4°C和100%相对湿度。确保环境湿度恒久保持在100%，寥落是在4°C条目下操作，可最大规则减少样品挥发。

器具搜检与清洁：确保使用的镊子厉害、对称对皆，并经过酒精透澈清洁。用高纯度洗涤剂(2% Micro-90)清洁乙烷杯、载网盒架和泡沫杜瓦瓶，随后用超纯水透澈冲洗并干燥。

冷冻介质准备：在冷冻浸渍器充分均衡后(至少20分钟)，使用液氮冷却浸渍杜瓦瓶，然后用乙烷填充中央杯。把稳：液态乙烷具有潜在危机性，操作时必须指挥安全眼镜。确保乙烷温度刚好高于其熔点90K。

载网准备：通过上述氢等离子体处理使载网亲水。仅使用干净、平整、无缺的载网，盘曲的载网在冷冻浸渍过程中会进一步损坏。

样品加载与吸水：将载网安装在清洁的冷冻浸渍器镊子上，在箔面上精准施加3微升卵白质溶液(经常浓度为10-5000 nM)，把稳不要让吸管顶端搏斗载网名义。使用预设的吸水参数进行操作，保举不使用"恭候时分"或"排水时分"，以加速过程并最小化样品与气-水界面的搏斗时分。

图10 载网的玻璃化和安装。（A）盘曲的载网在低温冷冻过程中会受损，导致箔片闹翻。B面板展示了一个闹翻的金箔示例（比例尺2μm）。载网还需要正确安装在显微镜卡盒中。C面板自满了在Krios卡盒中安装不正确且因此受损的载网。D面板中的载网安装正确。C和D面板中的比例尺为500μm。

快速冷冻：将样品浸入液态乙烷中，恭候约一分钟让镊子充分冷却。随后通过液氮上方的冷蒸汽注重性将冷冻样品迁移到存储盒中，开释镊子持力时轻轻让固化的乙烷从载网上剥落。将载网存放在带盖、象征的载网盒中，置于液氮存储杜瓦瓶中耐久保存。

把稳事项：全程幸免载网与任何物体搏斗碰撞。任何被碰撞或盘曲的载网都应丢弃。经常，通过调养等离子体涌现时分和吸水力度来优化冰层厚度。对于亲水性不足的载网，经常会不雅察到载网方孔中心的冰层显然增厚，这是由于疏水名义摈弃液体所致。

高分辨率数据聚集

与大多数科学仪器一样，电镜过甚探伤系统的性能与竣事此性能所需的资源参加之间存在显然权衡。鉴于结构生物学权衡的压根策划是获取足够高分辨率的生物结构以明确解答科常识题，咱们需要在仪器性能与数据质料、数目之间寻求最好均衡点（图1）。

基于现存工夫，咱们以为将更多元气心灵参加于样品制备优化是最具效益的计策，因为不论刻下或异日，样品性量仍将是决定分辨率和密度图可诠释性的要道因素。

生物样品电子显微成像主要受限于电子束导致的样品毁伤。因此，电子探伤器的量子效用成为影响成像质料的最进军单一因素。基于现在对探伤量子效用(DQE)的意会及各式买卖探伤器的测量数据，咱们在表1中回归了当代探伤器的要道参数及保举电子通量。这些参数联接照明条目和样品出动戒指因素，组成了表2中保举成像条目的基础。这些冷落可四肢权衡东说念主员在数据量、分辨率和仪器时分等因素间进行弃取的最先，并将随工夫逾越不休更新。

表2 MRC LMB刻下保举的数据聚集设立

ᵃDQE在约80 keV时对于磷光体耦合CCD最大，但在120 keV时样品充电效应和平均解放程较低。

ᵇ像素大小受通量铁心而非空间分辨率铁心。

咱们在此提供一套应用于配备Falcon 2探伤器的Titan Krios电镜的高分辨率数据聚集尺度经由。基于表1和表2中的参数设立，此有策划可活泼调养以适当不同样品类型及显微镜成就，确保最好成像效果。

有策划10：使用Krios/Falcon 2和全金撑持进行高分辨率数据聚集

1样品装载：将样品和校准载网(PtIr、石墨化碳或雷同物)装入卡盒并安装在自动加载器中。丢弃通盘在处理过程中盘曲或破碎的样品。

2样品搜检：将样品装入柱中，使用低倍率搜检载网完整性和冰层厚度。可通过加多几百微米的离焦来提升下倍率下的对比度，以更准确判断冰层厚度。

3电镜系统校准：在采取样品后，加载校准载网并在低剂量曝光格局下奉行全面的电镜瞄准，包括电子枪瞄准、聚光器和物镜光阑瞄准、电子束歪斜、相机增益矫正以及聚光器和物镜像差矫正。

4数据聚集区域遴荐：再行加载所选样品，使用低倍率和高离焦找到通盘适当数据聚集的方孔。冷落使用自动化软件在低倍率下创建图像拼接(图集)辅助遴荐。通盘用于数据聚集的方孔应无罅隙、结晶冰和稠浊。

5参数考据与优化：聚集几个测试显微像片，阐述冰相、厚度和颗粒散布。在曝光格局下通过电子束歪斜或不雅察孔边际的条纹/亮点来精准设立焦距。搜检曝光格局下电子束的照明几何局势，确保电子束呈圆形、以成像轴为中心、以孔为中心，同期包围孔周围撑持的环形区域。

6 数据聚集：脱手精采数据聚集，可手动操作或使用自动数据聚集软件。冷落每聚集20-30个孔搜检一次焦点和照明景色。如系统安装正确，80μm方孔内的焦点变化应小于1-2μm。为考据数据质料，冷落聚集总显微像片的1-2%四肢歪斜对照组，经常使用[0,15°]的歪斜角度和[1,3秒]的曝光时分。

领受径直电子探伤器网罗的每组数据均需进行严格教练，以确保样品制备和照明条目已达到最优，从而将颗粒畅通降至最低。现阶段，最为灵验的教练有策划是对每张显微像片应用畅通矫正轨范，如motioncorr。

在尺度操作经由中，每张显微像片以电影格局聚集，总放射剂量被分割为多个零丁帧。畅通矫正算法粗略精准识别样品随时分的合座位移。该轨范运算高效，使权衡东说念主员粗略在成像过程中实时评估样品撑持的瓦解性。

本权衡在Titan Krios电子显微镜上搭配Falcon 2径直电子探伤器（像素尺寸为1.7Å）进行实验，曝光时分为1秒，电子剂量为16 e/Ų。权衡扫尾（图11）自满，在雷同保举对称条目下聚集的两组数据呈现显赫互异：全金撑持上的畅通小于1.5Å，不足一个像素；而尺度Quantifoil撑持上的畅通大小则高出一个数目级。

图11 在数据网罗时代或之后检测样品出动。在数据聚集过程中，不错使用实时快速傅里叶变换（FFTs）检测遍及的样品出动或载物台漂移。图中自满了莫得载物台漂移（A）和以10 Å/秒温度引起的载物台漂移（B）的样品FFTs。显微像片C自满了保举的对称照明，照耀吊挂在全金撑持膜孔上的冷冻样品。直方图自满了在C中所示的雷同对称照明条目下，全金撑持与金上无定形碳（Quantifoil）上1秒显微像片（16 e⁻/Ų）的平面出动统计。插图为直方图原点隔邻的放大图。

鉴于当代超瓦解撑持与低漂移电镜载物台的组合使用，样品撑持的合座位移理当聊胜于无。因此，显微像片畅通追踪算法不仅可用于通例检测，还可四肢会诊器具，匡助权衡东说念主员识别数据聚集设立不实、载物台漂移或载网损坏等问题，从而确保获取最高质料的电镜数据。

参考贵府

L.A. Passmore, C.J. Russo, Specimen Preparation for High-Resolution Cryo-EM, Methods in Enzymology,2016

开头于老千和他的一又友们，作家孙千

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